Institut für Polymorphismus- und Mutationsanalytik

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Real-Time PCR-Basis-Kurs (Mai)

Gendiagnostik:20180516
Gendiagnostik:20180517

Gendiagnostik:20180518
 

Inhalte & Lernziele

Die Real Time PCR hat sich als Standard-Methode für den Nachweis, die Quantifizierung und auch Genotypisierung von DNA/RNA etabliert. Neben den theoretischen Grundlagen der qPCR, dem Versuchsaufbau und der Auswertung der Daten, stehen drei Experimente modelhaft im Zentrum: die Bestimmung der Nachweis-und Quantifizierungsgrenze, die Genotypisierung mittels HRM und Sonden sowie die relative Quantifizierung in einer Expressionsstudie und ihre Auswertung.   

Im theoretischen Teil werden u.a. folgende Themen behandelt:

  •  Prinzip der Real Time PCR unter anderem unterschiedliche Detektionsformate und Geräteplattformen (Eva-Green, Sonden, Multikanal-Detektion mit/ohne ROX)
  • Interpretation und Daten-Auswertung: Ct-Werte, Threshold-Setting, Baseline, Schmelzkurve, Methoden der Effizienz-Bestimmung und Rechnen mit Delta CT
  • Genotypisierung mittels HRM und Sonden-Systemen (FRET)
  • Qualifizierung der RNA und cDNA, Primer-und Sonden-Design und Analyse der geeigneten endogenen Referenz und verschiedene Auswertemethoden
  • Trouble Shooting: Integrität der RNA/cDNA, Kontamination, Anzahl und Größe der Replikate

Der Praxisteil umfasst:

  • Nachweis und Quantifizierung von Legionellen mittels Standardkurve (LOD, LOQ)
  • Genotypisierung mittels HRM und Sonden-Systemen
  • Präparation von RNA, cDNA-Synthese, relative Quantifizierung
  • Verschiedene Auswertungsmethoden werden mit den Kursdaten demonstriert

Die Teilnehmer erhalten eine Schritt für Schritt Arbeitsanleitung (qPCR-Fibel) für die durchgeführten Experimente.

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