Institut für Polymorphismus- und Mutationsanalytik

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Real Time PCR Aufbaukurs: Genexpressionsanalyse

Gendiagnostik:20181121
Gendiagnostik:20181122
Gendiagnostik:20181123
 

Inhalte & Lernziele

Genexpressionsanalysen liefern Informationen über die Umsetzung der genetischen Information und darüber, wie sich Gene unter verschiedensten Bedingungen verhalten. Zelltypen und Gewebe exprimieren unter verschiedenen Versuchsbedingungen nur einen bestimmten Teil aller Gene in unterschiedlicher Intensität, während die übrigen Gene „abgeschaltet“ sind. Für quantitative Analysen dieser Genregulationen hat sich die reverse Transkription mit anschließender Real Time PCR bewährt.
In diesem Kurs erlernen Sie die Planung von Genexpressionsanalysen.

Im theoretischen Teil werden u.a. folgende Themen behandelt:

  • Aufbau und Struktur von DNA, RNA und Genomen
  • Exon-Intron-Struktur, Primer-Design für eine optimale Multiplex-Sonden-PCR
  • Prinzip der Real Time PCR und unterschiedliche Detektionsformate
  • Grundlagen der Real Time PCR: Ct-Werte, Threshold, Baseline
  • Auswahl und Analyse der geeigneten endogenen Referenz
  • Relative Quantifizierung mit Standard-Kurve und mittels deltaCT
  • Trouble Shooting

Der Praxisteil umfasst:

  • Präparation von total-RNA, mRNA und deren Quantifizierung
  • Nachweis der RNA-Integrität mittels PCR und Prüfung der Abwesenheit von gDNA (Alu-PCR)
  • Methoden der cDNA-Synthese (Oligo-dT, random und Gen-spezifisches Priming)
  • Bestimmung von Effizienz, Bestimmungswert und Auswahl geeigneter endogener Referenzen
  • Relative Quantifizierung mit den Kursdaten
  • Überprüfung auf MIQE-Konformität
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